Chip-seq的实战学习

Chip-seq pipline

参考文章：
CHIP-seq基础入门
一个CHIP-seq的实战

Chip-seq属于蛋白组学，利用蛋白和DNA序列的结合以及蛋白和抗体的结合讲DNA片段拉下来，实验步骤主要包括一下几步：
第一步： 将蛋白交联到DNA上。 也就是保证蛋白和DNA能够结合，找到互作位点
第二步： 通过超声波剪切DNA链
第三步： 加上附上抗体的磁珠用于免疫沉淀靶蛋白；抗体很重要
第四步： 解除蛋白交联；纯化DNA

下载数据

数据来源：GSE42466

for i in `seq 4 9`;do
mwget -d ~/project/chipseq/fastq/ ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR62020$i/SRR62020$i.sra
done

将sra格式的数据转换为fastq.gz格式

cd ~/project/chipseq/fastq/

for i in `ls *.sra`;do
fastq-dump --split-3 $i
done

我们注意到，这次的测序数据是单段测序的数据，read length为40bp和36bp.

数据质控

1. fastqc批量检测数据质量

   ls *fastq|xargs fastqc -t 10 -o ~/project/chipseq/fastqc/
   

2. 使用multiqc综合多个文件的测序质量报告

   multiqc ~/project/chipseq/fastqc/
   

   multiqc在使用是可能会因为编码问题报错，解决办法参考python3官网
   在使用multiqc的过程中遇到了另外一个问题，pkg_resource.VersionConfilct，更新了一下Multiqc,突然就又能用了，一脸懵….

序列比对

1. bowtie2
   使用bowtie2进行比对，由于上面的质控报告显示3’端有几个碱基的质量很低,所以我们用-3 5切掉5个bp。

   bowtie2 -p 10 -3 5 -x /home/j..x../ref/mm10/mm10 -U ~/project/chipseq/fastq/SRR620204.fastq | samtools sort -@ 10 -O bam -o ring1B.bam
   

   bowtie2的索引文件需要给出索引文件的前缀，比如mm10.1.bt2,mm10.2.bt2需要写出mm10
   bowtie2的比对过程很快，3个G的数据我用—local的参数只用了20分钟就比对外加排序结束
   使用samtools flagstat统计比对上的比例：

   samtools flagstat xxx.bam
   

   比对率：

   cbx7: 86.88%
   IgG: 81.74%
   IgGold: 56.88%
   ringB1: 59.75%
   RYBP: 83.28%
   suz12: 66.05%
   

2. 过滤bam文件
   这步为选作选项
   我们需要去除没有比对上的，以及重复比对的和pcr扩增的重复序列

   #过滤没有比对上或者质量小于5的reads
   for i in cbx7 IgG IgGold ringB1 RYBP suz12;do
   samtools view -h -F 4 -q 5 $i.bam | samtools view -bS > $i.filter.bam
   done
   #去除pcr重复
   for i in cbx7 IgG IgGold ringB1 RYBP suz12;do
   samtools rmdup -s $i.filter.bam $i.filter.rmdup.bam
   done
   

序列富集

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